上一期小賽給大家分享了一篇KingFisher純化細(xì)胞的文章，獲得了很多小伙伴的關(guān)注，這次小賽又給您帶來(lái)了一篇KingFisher做蛋白純化的文章，KingFisher儀器不僅能用于新冠病毒的檢測(cè)，還能用于新冠藥物靶點(diǎn)的研究。

2020年5月，一篇名為 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的重磅論文在Nature上發(fā)表，推動(dòng)治療新冠藥物的研發(fā)進(jìn)程。論文通過(guò)揭示SARS-CoV-2病毒與人類(lèi)蛋白相互作用（protein–protein interaction, PPI）的圖譜來(lái)揭示病毒如何劫持細(xì)胞系統(tǒng)，找到了332個(gè)SARS-CoV-2蛋白與人類(lèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，并鑒定出69種能靶向干擾的化合物。這項(xiàng)研究無(wú)論對(duì)于“老藥新用”治療新冠疾病，還是對(duì)于指明新藥的研發(fā)方向，都有重要的意義。

值得一提的是

科學(xué)家在研究中使用了全自動(dòng)純化系統(tǒng)KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和質(zhì)譜分析儀Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 來(lái)實(shí)現(xiàn)親和純化質(zhì)譜（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），找到了藥物靶點(diǎn)，為新冠藥物開(kāi)發(fā)助力。

研究方法

他們首先單獨(dú)研究了 29 種 SARS-CoV-2 蛋白中的 26 種（表1）。

表1. SARS-CoV-2蛋白表，包括分子質(zhì)量、與SARS-CoV同源物的序列相似性以及基于SARS-CoV同源物的推斷功能。

如何找到這26種病毒蛋白會(huì)與人體里的哪些蛋白產(chǎn)生相互作用呢？

研究人員利用在 HEK293T/17 細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)行親和純化質(zhì)譜（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒蛋白經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化并克隆到帶有親和標(biāo)簽（或誘餌）的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。在宿主細(xì)胞中表達(dá)這些病毒蛋白后，通過(guò)高通量的純化系統(tǒng)KingFisher Flex，在與宿主蛋白相互作用的背景下純化病毒蛋白并通過(guò)多次純化洗滌，盡量避免雜蛋白的干擾。結(jié)合質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)，生成SARS-CoV-2蛋白和人類(lèi)蛋白之間的 PPI 圖譜（圖1）。

圖1. AP-MS鑒定SARS-CoV-2宿主蛋白-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)流程。

根據(jù)這些蛋白相互作用的數(shù)據(jù)，科學(xué)家們?cè)谝呀?jīng)批準(zhǔn)的藥物、正在臨床試驗(yàn)的藥物、以及尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)的化合物中，尋找能夠選擇性干擾病毒蛋白-人類(lèi)蛋白相互作用的分子。

為了進(jìn)一步證明藥物的抗病毒性，研究團(tuán)隊(duì)與兩個(gè)正在實(shí)驗(yàn)室中處理 SARS-CoV-2 病毒的研究小組合作，在 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)病毒檢測(cè)中測(cè)試病毒。

主要發(fā)現(xiàn)1

繪制SARS-CoV-2病毒蛋白與人體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

研究團(tuán)隊(duì)首次系統(tǒng)分析了SARS-CoV-2在感染過(guò)程中可能與哪些人類(lèi)蛋白質(zhì)相互作用。用親和純化質(zhì)譜法（AP-MS）對(duì)27個(gè)標(biāo)記的病毒蛋白（26種新冠病毒蛋白和1種突變體蛋白）進(jìn)行分析，基于蛋白質(zhì)之間的相互作用，確定新冠蛋白與人類(lèi)蛋白質(zhì)的作用關(guān)系，并鑒定了332種高置信度新冠蛋白-人類(lèi)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

圖2. SARS-CoV-2蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。26種SARS-CoV-2蛋白(紅色菱形)與人類(lèi)蛋白(圓形;藥物靶點(diǎn):橙色;蛋白復(fù)合物:黃色;同一生物過(guò)程中的蛋白質(zhì):藍(lán)色)之間332種具有高置信度的相互作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證互作蛋白，研究團(tuán)隊(duì)研究了人類(lèi)相互作用蛋白的生物學(xué)功能、解剖表達(dá)模式、SARS-CoV-2感染期間的表達(dá)變化以及與宿主-病原體相互作用蛋白的其他圖譜?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)這些新冠病毒蛋白參與基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程。約40%蛋白互作蛋白與內(nèi)室或者囊泡運(yùn)輸途徑有關(guān)。其中新冠病毒會(huì)對(duì)多條先天免疫系統(tǒng)通路如干擾素通路和 NF-κB通路等產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，兩個(gè)調(diào)節(jié)抗病毒先天免疫信號(hào)通路的人類(lèi)蛋白，也會(huì)被新冠病毒蛋白所靶向和針對(duì)。

主要發(fā)現(xiàn)2

篩選干預(yù)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的現(xiàn)有藥物

通過(guò)研究蛋白互作，科學(xué)家找到了這些潛在的藥物靶點(diǎn)。通過(guò)整理這些會(huì)與新冠蛋白相互作用的蛋白信息，科學(xué)家們對(duì)比FDA的數(shù)據(jù)，在已經(jīng)批準(zhǔn)的藥物、正在臨床試驗(yàn)的藥物、以及尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)的化合物中，找到了69個(gè)能夠選擇性干擾新冠蛋白與人類(lèi)蛋白相互作用的化合物（圖3）。在這69種化合物中，27種為已經(jīng)通過(guò)FDA批準(zhǔn)上市的藥物，另外還有14種藥物目前還處于臨床研究階段，剩余28種還未進(jìn)入臨床研究。

圖3. 藥物和人類(lèi)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)。圖中顯示了SARS-CoV-2毒餌與已批準(zhǔn)藥物(綠色)、臨床候選藥物(橙色)和臨床前候選藥物(紫色)的蛋白-蛋白相互作用，以及針對(duì)宿主蛋白(白色背景)或已知宿主因子(灰色背景)的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。

是否這69種化合物都具有抗病毒活性呢？為了在體外測(cè)試這些藥物，他們?cè)诩~約和巴黎做了病毒感染性實(shí)驗(yàn)（圖4）。在紐約西奈山醫(yī)院，他們開(kāi)發(fā)了一種中通量免疫熒光技術(shù)分析(檢測(cè)病毒NP蛋白)篩選37種化合物，研究Vero E6細(xì)胞系SARS-CoV-2感染的抑制作用；在法國(guó)的巴斯德研究所，另一批科學(xué)家通過(guò)PCR (RT-qPCR)檢測(cè)44種藥物和化合物。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了兩類(lèi)分子能減少病毒的感染性：mRNA 翻譯抑制劑和 Sigma1 和 Sigma2 受體的預(yù)測(cè)調(diào)節(jié)因子。后續(xù)研究表明，這些分子作用于病毒入侵細(xì)胞之前，可以起到阻斷病毒感染的作用。

圖4. 病毒感染性試驗(yàn)示意圖。

為了理解這些抑制劑發(fā)揮抗病毒作用的機(jī)制，科學(xué)家進(jìn)行了時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)，在感染前或感染后不同時(shí)間添加藥物。結(jié)果顯示（圖5）PB28、佐他替芬 (Zotatifin) 和羥基氯喹均降低了病毒的檢出，此外，這三種分子在病毒侵入后的感染后4小時(shí)內(nèi)均能抑制NP的表達(dá)。因此，這些分子似乎在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮其抗病毒作用。

圖5. 感染前后添加藥物的抗病毒作用區(qū)別。在添加高滴度病毒(MOI = 2)之前或之后添加藥物，抗病毒效果相似。

在本研究中，KingFisher Flex幫助研究人員解決了以下問(wèn)題：

1. 純化的均一性。96通量蛋白樣本在親和純化時(shí)在同一條件下完成，實(shí)驗(yàn)更嚴(yán)謹(jǐn)。

2. 提高實(shí)驗(yàn)效率。AP-MS實(shí)驗(yàn)涉及大量的標(biāo)簽蛋白純化，全自動(dòng)純化系統(tǒng)KingFisher Flex代替手工操作，節(jié)約時(shí)間，可重復(fù)性強(qiáng)。

3. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。多檔速度可調(diào)搭配高吸附磁珠，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，盡可能多的標(biāo)簽蛋白被純化出來(lái)，提高藥物靶點(diǎn)研究的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468