近期已經(jīng)證明，細胞外囊泡 (EV) 攜帶 DNA。然而，EV中 DNA (EV-DNA) 的許多基本特征仍然難以捉摸。
2022年4月4日，廈門大學顏曉梅團隊在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在線發(fā)表題為“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究論文，該研究通過納米流式細胞儀 (nFCM) 可以檢測直徑小至 40 nm 的單個 EV 和 SYTO 16 染色后 200 bp 的單個 DNA 片段，用于研究單個囊泡處的 EV-DNA。
通過同時對單個顆粒進行側向散射和熒光 (FL) 檢測并結合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體相關的 DNA 大量存在于由細胞培養(yǎng)物制備的 EV 樣品中（超速離心培養(yǎng)基）；(2) 單個 EVs 中 EV-DNA 的數(shù)量表現(xiàn)出很大的異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的數(shù)量在 30% 到 80% 之間變化，具體取決于細胞類型；(3) 外部 EV-DNA 主要定位在相對較小的 EVs 上（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外部 DNA+ EVs 的分泌可以通過抑制外泌體分泌途徑顯著減少；(4) 內部 EV-DNA 主要封裝在相對較大的 EV 的管腔內（例如 HCT-15 細胞系為 80-200 nm）；(5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外部和內部 EV-DNA 的主要形式；(6) EVs 中未發(fā)現(xiàn)組蛋白 (H3)，EV-DNA 與組蛋白不相關，(7) 基因毒性藥物誘導 DNA+ EVs 的釋放增加，外部DNA+ EVs和內部DNA+ EVs的數(shù)量以及單個EVs中的DNA含量均顯著增加。這項研究為深入了解 DNA 與EV的關聯(lián)提供了直接和確鑿的實驗證據(jù)。
細胞外囊泡 (EVs) 是由幾乎所有細胞類型分泌的納米級膜囊泡，通過將蛋白質、核酸和脂質從供體細胞轉移到受體細胞來介導細胞間通訊。研究表明，EV中存在基因組 DNA、線粒體 DNA 甚至病毒 DNA。通過 DNA 的包裝和水平轉移，EV 在維持細胞穩(wěn)態(tài)、調節(jié)免疫反應和調節(jié)腫瘤進展方面發(fā)揮著重要的作用。
基于 EV 中的 DNA (EV-DNA) 開發(fā)了用于腫瘤診斷的液體活檢測試。盡管已經(jīng)認識到 EV-DNA 的生物學意義，但對 EV-DNA 的探索較少，許多基本特征仍存在爭議，例如 DNA 是否與所有或部分 EV 亞群相關？EV-DNA 是否位于內腔和/或 EV 表面？DNA含量和EV大小之間有什么關系？EV-DNA 是單鏈 DNA (ssDNA) 還是雙鏈 DNA (dsDNA)？對 EV-DNA 的研究通常通過從 EV 分離物中提取 DNA，然后進行豐度、片段長度和序列評估來進行。通過將 DNase 酶消化與 Fragment Analyzer 系統(tǒng)相結合，研究了 DNA 的相對豐度和定位（管腔內或與 EV 表面相關）。為了闡明 EV-DNA 在 EV 亞群之間的異質性，對分離的 EV 進行 DNA 分析通過密度梯度離心或不對稱流場-流分餾已經(jīng)進行。盡管批量分析能夠識別不同 EV 亞群中的 DNA，但結果可能存在爭議，因為 EV-DNA 無法與無細胞 DNA 區(qū)分開來。由于 EV 的大小和貨物含量差異很大，因此迫切需要單粒子技術來破譯 EV-DNA 的內在異質性，并將 EV-DNA 與游離 DNA 或其他污染物區(qū)分開來。然而，EV 的納米級粒徑（大多數(shù)大小 <100 nm）和 EV-DNA 的低含量使其成為一個挑戰(zhàn)。
在過去的十年中，研究人員一直致力于開發(fā)一種高靈敏度的納米流式細胞儀。它已實現(xiàn)對單個 EV、病毒、二氧化硅納米粒子和金納米粒子的光散射檢測，分別小至 40、27、24 和 7 nm。對于熒光 (FL) 檢測，檢測到單個 R-藻紅蛋白分子的信噪比為 17，有機染料的檢測限確定為三個 Alexa Fluor 532 分子。
在本研究中，嘗試通過將酶消化與 nFCM 相結合，在單囊泡水平上分析外部和內部 EV-DNA。研究了 DNA+ EV 的百分比以及 DNA 含量分布與 EV 大小、ssDNA 和 dsDNA 之間的區(qū)別、EV-DNA 和組蛋白的關聯(lián)以及抗癌藥物治療后 DNA 含量的改變。通過同時對單個顆粒進行側向散射和熒光 (FL) 檢測并結合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體相關的 DNA 大量存在于由細胞培養(yǎng)物制備的 EV 樣品中（超速離心培養(yǎng)基）； (2) 單個 EVs 中 EV-DNA 的數(shù)量表現(xiàn)出很大的異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的數(shù)量在 30% 到 80% 之間變化，具體取決于細胞類型； (3) 外部 EV-DNA 主要定位在相對較小的 EVs 上（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外部 DNA+ EVs 的分泌可以通過抑制外泌體分泌途徑顯著減少； (4) 內部 EV-DNA 主要封裝在相對較大的 EV 的管腔內（例如 HCT-15 細胞系為 80-200 nm）； (5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外部和內部 EV-DNA 的主要形式； (6) EVs 中未發(fā)現(xiàn)組蛋白 (H3)，EV-DNA 與組蛋白不相關，(7) 基因毒性藥物誘導 DNA+ EVs 的釋放增加，外部DNA+ EVs和內部DNA+ EVs的數(shù)量以及單個EVs中的DNA含量均顯著增加。這項研究為深入了解 DNA 與EV的關聯(lián)提供了直接和確鑿的實驗證據(jù)。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
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